Journal of Biological ChemistryVolume 297, Issue 1, July 2021, 100867
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Decoding molnupiravir-induced mutagenesis in SARS-CoV-2
https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100867
モルヌピラビルは、ヌクレオシド誘導体であるβ-D-N4-ヒドロキシシチジン（NHC）のプロドラッグであり、現在、COVID-19療法として臨床試験が行われている。しかし、モルヌピラビルによる突然変異誘発に関わる生化学的なメカニズムについては、これまで検討されていなかった。Gordonらは、最近の研究で、NHCがウイルスのRNAに取り込まれ、その後伸長してRNA依存性RNA合成の鋳型として使用されることを示し、利用可能なウイルス学的証拠と一致する変異誘発モデルを提案した。この研究では、モルヌピラビルがSARS-CoV-2をエラーカタストロフに導く分子メカニズムを明らかにした。
コロナウイルスは、26.4～31.7キロベースの正センス一本鎖RNAゲノムを持つエンベロープ型ウイルスである。コロナウイルスのゲノムには、ウイルスゲノムの複製と転写を担う非構造タンパク質がコードされており、その主な構成要素は、中央にRNA依存性のRNAポリメラーゼ（RdRp）ドメインを含む多機能タンパク質である(1)。ウイルスのポリメラーゼは、抗ウイルス剤の一般的な標的であり、ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログは、最も効果的な抗ウイルス剤のバックボーンを構成している(2)。
現在、COVID-19の治療薬として承認されているのは、レムデシビルと呼ばれるヌクレオチド類縁体のみである。しかし、いくつかの臨床試験では、その有益な効果が確認できなかった。さらに、この薬は合成が難しく、高価であり、病院で静脈内投与しなければならないという問題がある。これらの特性は、パンデミックという状況下では望ましくなく、SARS-CoV-2複製の代替阻害剤の開発に力が注がれている。その中でもモルヌピラビルは、コロナウイルスのRNAポリメラーゼを標的とした有望な新薬として注目されている。
モルヌピラビルは、リボヌクレオシドアナログであるβ-D-N4-ヒドロキシシチジン（NHC）のイソプロピルエステル型プロドラッグである。NHCは、細胞培養中の複数のウイルス（チクングニアウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、呼吸器シンシチアルウイルス、C型肝炎ウイルス、ノロウイルス、A型およびB型インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ヒトコロナウイルスなど）の複製を阻害する広域抗ウイルス化合物である(3)。
NHCの三リン酸誘導体は、ウイルスのRNAポリメラーゼの基質となり、ウイルスの複製を妨害する。細胞培養アッセイにおいて、モルヌピラビルはSARS-CoV-2の複製をサブマイクロモル領域のEC50で強力に阻害することがわかった（3, 4）。この阻害効果は、シリアン・ハムスターやヒト化マウスなどの動物モデルでも確認され(5, 6)、感染したフェレットにNHCを投与することで、未投与および未感染の動物へのSARS-CoV-2感染を防ぐことができた(7)。
モルヌピラビルは、前臨床試験のデータが有望であること、第I相臨床試験で毒性や副作用が認められなかったことから、現在、第II/III相臨床試験が行われている。アルファーウイルスやコロナウイルスを用いた細胞培養実験では、NHCの変異原性が示されており、用量依存的にG→AおよびC→Uの遷移が誘発される。しかし、これらの作用を媒介する生化学的な事象については、生化学的なレベルでの研究は行われていなかった。
Gordonら（8）は，SARS-CoV-2のRdRpホロ酵素と様々なRNA-RNAテンプレートプライマーを用いて，異なる配列コンテクストにおけるNHC三リン酸と天然リボヌクレオシド三リン酸（rNTP）のヌクレオチド取り込み効率を測定した。ポリメラーゼ触媒速度定数（kpol）とヌクレオチド結合親和性（Kd）の正確な測定はできなかったが、その結果、すべてのrNTPがNHC三リン酸よりも効率的に取り込まれることが明らかになった。しかし、予想通り、シトシン三リン酸（CTP）との競合が最も効率的であることがわかった。Gordonらは別の実験で、一度取り込まれたNHC一リン酸を3’末端に持つプライマーは、特に高いrNTP濃度で効率的に伸長することを見出した。
この観察結果を受けて、著者らは、鋳型のNHCがSARS-CoV-2のRNA合成時のエラー発生に影響を与えているかどうかを調べた。NHC一リン酸が埋め込まれたRNAテンプレートを合成してRNA伸長実験に用いたところ、NHC:AとNHC:Gの両方の塩基対が形成されることが確認された。しかし、効率的な伸長は、NHC:Aの塩基対が形成された場合にのみ観察された。これらの生化学的データから、著者らはNHCの変異原性抗ウイルス作用を説明するモデルを提案した（図1）。NHC:Gの塩基対が形成されるとRNA合成が阻害されるのに対し、NHC:Aの塩基対が形成されるとG→AおよびC→Uの遷移頻度が増加して変異誘発が起こるというもので、過去にin vitroおよびin vivoで行われた実験で得られた証拠と一致している（3, 6）。
Figure 1. Proposed model for the antiviral mechanism of molnupiravir, based on NHC-induced mutagenesis and inhibition of RNA synthesis.
実験に用いたRdRpホロ酵素には、SARS-CoV-2のレプリカ-トランスクリプターゼ複合体に含まれるexoribonucleaseタンパク質が含まれていないが、関連するMERS-CoVタンパク質の校正活性はNHCによって効果的に阻害される(3)。したがって、RNAポリメラーゼホロ酵素に対するモルヌピラビルの作用についての結論は、完全なレプリカ-トランスクリプターゼ複合体に対しても有効であると考えられる。
致死的突然変異誘発は、多くのRNAウイルスの高い突然変異率と低い突然変異耐性を利用した広範な抗ウイルス戦略である。他の変異原性ヌクレオシドを用いて細胞培養でウイルスの絶滅に成功した例も多数報告されている。しかし、致死的な変異原性については、動物やヒトでの検証がまだ必要である。リバビリンやファビピラビルのような認可されたヌクレオシドについては、さまざまなウイルスで変異原性が示されている。リバビリンはGからA、CからUへの変異頻度を増加させるのに対し、ファビピラビルはAからG、UからCへの移行を促進する（参考文献(9)参照）。(9)). ファビピラビルは、日本ではインフルエンザの治療薬として承認されており、中国とロシアではCOVID-19の治療薬として認可されている。
Zhouらの最近の研究(10)では、SARS-CoV-2に対して、NHCはリバビリンやファビピラビルに比べて100倍以上の活性を示し、その活性はウイルスRNAの変異頻度の増加と相関していることが示された。Gordonら(8)の方法論が、SARS-CoV-2やインフルエンザウイルス感染症におけるファビピラビルの潜在的な作用機序に光を当てることができるかどうかは興味深いところである。
利用可能な証拠から、モルヌピラビルは、抗ウイルス戦略としての致死的突然変異誘発の使用におけるパラダイムの例となる可能性がある。
しかし、このアプローチには固有のリスクがある。NHCは、宿主細胞でリボヌクレオチド還元酵素により2′-デオキシリボヌクレオシド型に代謝され、宿主細胞のDNAに取り込まれる。NHCの変異原性は動物細胞培養で示されており(10)、モルヌピラビルによる腫瘍形成の潜在的リスクや、精子前駆細胞の生成および胚の発生における有害な変異の出現が懸念される。
8C.J. Gordon, E.P. Tchesnokov, R.F.Schinazi, M. GötteMolnupiravir promotes SARS-CoV-2 mutagenesis via the RNA templateJ. Biol. Chem., 297 (2021)100770
https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100770
9C. Perales, I. Gallego, A.I. de Ávila, M.E.Soria, J. Gregori, J. Quer, E. DomingoThe increasing impact of lethal mutagenesis of viruses Future Med. Chem., 11 (2019), pp. 1645-1657
https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2021.105078
By testing seven commonly used nucleotide analog viral polymerase inhibitors, Remdesivir, Molnupiravir, Ribavirin, Favipiravir, Penciclovir, Entecavir and Tenofovir, we found that both Molnupiravir and Remdesivir showed the strong inhibition of SARS-CoV-2 RdRp, with EC50 value of 0.22 μM and 0.67 μM, respectively. Moreover, our results suggested that exoribonuclease nsp14 increases resistance of SARS-CoV-2 RdRp to nucleotide analog inhibitors.
→残念ながら、ファビピラビル(アビガン)の抗ウイルス作用は、MSDが開発中のモルヌピラビルよりも、300倍も効果が低い。
Fig. 3. Dose-dependent inhibition CoV-Gluc.HEK293T cells were transfected with CoV-Gluc, nsp12, nsp7, and nsp8 plasmid DNA at the ratio of 1:10:30:30. 12 h post transfection, cells were re-seeded in 96-well plates (104/well), and treated with serially diluted Remdesivir (A), Ribavirin (B), Favipiravir (C), Penciclovir (D), Entecavir (E), Tenofovir (F). After 24 h incubation, Gluc activity in supernatants was determined. To assess cell viability, HEK293T cells (104/wells) were seeded in 96-well plates, and treated with these inhibitors as indicated above. The CC50 values were measured with the cell counting kit-8. Results shown are the average of three independent experiments.
Fig. 4. Inhibition of CoV-Gluc RNA expression by NAs. HEK293T cells were transfected with CoV-Gluc, nsp12, nsp7, nsp8 plasmid DNA at the ration of 1:10:30:30. 6 h post transfection, supernatants were replaced with fresh medium containing Remdesivir (A), Ribavirin(B), Favipiravir(C), Penciclovir(D), Entecavir(E), Tenofovir(F), respectively. Cells were cultured for 24 more hours, total cellular RNA was extracted, levels of CoV-Gluc were determined by real-time RT-PCR.
Fig. 5. Effect of nsp14 and nsp10 on the responses of CoV-RdRp-Gluc to NA inhibitors.(A, B) HEK293T cells were transfected with CoV-Gluc, nsp12, nsp7, nsp8, nsp10, and nsp14 plasmid DNA at the ratio of 1:10:30:30:10:90. At 48 h post transfection, cell lysates were analyzed by Western blots using anti-Flag or anti-β-actin antibodies (A). Gluc activity in supernatants was determined and the results are shown in (B). (C) HEK293T cells were transfected with plasmids as described above. At 12 h post transfection, cells were re-seeded in 96-well plates (104/well), and treated with serially diluted NA inhibitors including Remdesivir, Ribavirin, Favipiravir, Penciclovir, Entecavir, and Tenofovir. After 24 h, Gluc activity in supernatants were quantified. Results shown are the average of three independent experiments.
Fig. 6. The nsp14 mutant does not affect NA inhibition of CoV-RdRp-Gluc reporter. (A, B) HEK 293T cells were transfected with CoV-Gluc, nsp12, nsp7, nsp8, nsp10, nsp14 or nps14 (D90A&E92A) at the ratio of 1:10:30:30:10:90. Western blotting was performed with anti-Flag or anti-β-actin antibodies, results are shown in (A). Gluc activity in supernatants was measured, results are shown in (B). (C) At 12 h post transfection, cells were re-seeded in 96-well plates (104/wells), and treated with NA inhibitors Remdesivir, Ribavirin, Favipiravir, Penciclovir, Entecavir, or Tenofovir. After 24 h, supernatants were analyzed for Gluc activity. Results shown are the average of three independent experiments.
10S. Zhou, C.S. Hill, S. Sarkar, L.V. Tse, B.M.D. Woodburn, R.F. Schinazi, T.P.Sheahan, R.S. Baric, M.T. Heise, R.Swanstromβ-D-N4-hydroxycytidine (NHC) inhibits SARS-CoV-2 through lethal mutagenesis but is also mutagenic to mammalian cellsJ. Infect. Dis. (2021), 10.1093/infdis/jiab247
変異原性のあるリボヌクレオシドは、広範囲の抗ウイルス剤として作用する。活性のあるリボヌクレオシド三リン酸型に代謝され、ウイルスの複製時にRNAウイルスのゲノムに濃縮される。β-D-N4-ヒドロキシシチジン（NHC，モルヌピラビルの初期代謝物）は，重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に対して，リバビリンやファビピラビルの100倍以上の活性を示し，抗ウイルス活性はウイルスRNAの突然変異のレベルと相関している。しかし、NHCは、動物細胞培養法においても宿主の変異活性を示し、RNAとDNAの前駆体がリボヌクレオシド二リン酸という共通の中間体を共有していることと一致した。これらの結果は、高活性の変異原性リボヌクレオシドが宿主にとって危険であることを示している。
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